由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用,它不象其它層析分離方式主要依賴于溶劑強度和選擇性的改變來進行分離,在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用,一般不依賴于流動相性質和組成的改變來提高分辨率,改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用,所以和其它層析方法相比,凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴格。
標準品是標記免疫分析定量的依據。標準品的正確與否直接影響樣品的測定結果。如果在連續測定中,或各實驗室之間使用的標準品不一致,則可影響到實驗結果的可比性。為此,對標記免疫分析所使用的標準品應滿足如下要求。
蛋白質溶液用透析除鹽時,正負離子透過半透膜的速度不相同,如(NH4)2SO4中的?透析速度快,而透析過程中膜內的?會生成H2SO4,使膜內蛋白質溶液呈酸性。因此,為避免蛋白質變性,用鹽析法純化蛋白質時,開始時應用0.1mol/L的NH4OH透析。此外,為了保證蛋白質在透析過程中不發生變性,可以將透析過程置于低溫下進行。
降解問題是RNA制備中常常到的問題。因為在 RNA 提取過程中,樣品儲存不當或裂解效率低等情況都會導致降解。對于 DNA 提取,降解不是一個大問題,因為對于 PCR,DNA 可以被剪切并且工作正常,如果不希望有較多剪切的 DNA,可以使用弱裂解的方法。
PCR技術問世于上世紀80年代。問世之初的PCR體系比較大,動輒以毫升計。現在的PCR體系要精巧多了,總體積可大可小。我們常接觸到的常規PCR以及熒光定量PCR的體系一般都在幾十微升,小到可以10微升左右。
DNA片段瓊脂糖凝膠電泳的原理與蛋白質的電泳原理基本相同,DNA分子在高于其等電點的pH溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。DNA分子在電場中通過介質而泳動,除電荷效應外,凝膠介質還有分子篩效應,與分子大小及構想有關。
不同熒光基團的熒光強度是有高有低的,例如FAM就是一個熒光強度相對較高的基團,我們偏向于將其安排給相對表達量比較低的目的基因,而熒光強度相對較低的基團可以用于檢測表達量比較高的如看家基因等,這樣會達到擴增曲線平臺期接近的目的,結果會比較美觀。
RT-PCR一般情況下是指反轉錄PCR(reverse transcription),盡管有些資料上說實時熒光定量PCR也(realtime fluores-cence quantitative PCR)也簡稱RT-PCR,但是這是不對的,不推薦。