抗酸染色的基本原理：
分枝桿菌的植物細胞內帶有很多的脂類，包圍著在肽聚糖的外邊，因此分枝桿菌一般不容易上色，要歷經加溫和增加上色時間來促進其上色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染劑融合后，就難以被酸堿性脫色劑褪色，故稱抗酸染色。
齊-尼氏抗酸染色法是在加溫標準下使分枝菌酸與石炭酸復紅堅固融合成一氧化氮合酶，用鹽酸乙醇解決都不褪色。當再加偏堿美蘭復染后，分枝桿菌依然為鮮紅色，而別的病菌及情況中的物質為深藍色。
制片：
（1）涂片：左手持菌液試管，右手持接種環，用接種環從試管培養液中取一環菌，于載玻片中央涂成薄層（事先在背面做好標記圓圈）即可，或先滴一小滴無菌水于載玻片中央，用接種環從斜面上挑出少許，與載玻片上的水滴混合均勻，涂成一薄層。 拔或塞試管塞時，應將試管口通過火焰略加燒灼，最后將接種環在火焰上燒灼滅菌。
（2）干燥：涂片后在室溫下自然干燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。
（3）固定：常用高溫進行固定。即手持載玻片一端，標本面朝上，在燈的火焰外側快速來回移動3~4次，共約3~4秒。要求玻片溫度不超過60℃，以玻片背面觸及手背皮膚不覺過燙為宜，放置待冷后染色。
染色：
（1）初染：滴加石炭酸復紅溶液2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現蒸汽即暫時離開，若染液蒸發減少，應再加染液，以免干涸，加熱5分鐘，待標本冷卻后用水沖洗。
（2）脫色：
（3）復染：用堿性美蘭溶液復染1分鐘，水洗，用吸水紙吸干后用
油鏡觀察:
1、油不要滴太多
2、在調節焦距的時候要特別注意與載玻片之間的距離不要弄壞工具
3、調節時應該從下往上調節
4、在使用油鏡之前，必須先經低、高倍鏡觀察，然后將需進一步放大的部分移到視野的中心。
5、用左眼觀察目鏡，并慢慢轉動細調節器至物象清晰為止。
如果不出現物象或者目標不理想要重找，在加油區之外重找時應按：低倍→高倍→油鏡程序。在加油區內重找應按：低倍→油鏡程序，不得經高倍鏡，以免油沾污鏡頭。
6、油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭上和標本上的香柏油擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。
結果判定:
1.干燥后油鏡觀察300個視野（觀察時間不少于4min），抗酸性細菌呈紅色，其它細菌或細胞呈藍色
2. 報告方式
2.1 未找到抗酸桿菌
2.2 找到抗酸桿菌±：可疑，發現抗酸桿菌1-2條/300視野
2.3 找到抗酸桿菌1+：發現抗酸桿菌3-9條/100視野
2.4 找到抗酸桿菌2+：發現抗酸桿菌1-9條/10視野
2.5 找到抗酸桿菌3+:發現抗酸桿菌1-9條/1視野
2.6 找到抗酸桿菌4+：發現抗酸桿菌≥10條/1視野
質量控制：
每次用卡介苗做陽性對照
大腸埃希菌ATCC25922做陰性對照
注意事項：
1.每一玻片只能涂一份標本，以防脫落混淆
2. 脫色時間需根據涂片厚薄而定，厚片可適當延長，以無紅色脫出為止
3. 冬季室溫過低時，染色時間要適當延長
4. 有時同一個抗菌體上紅色深淺也有不同，觀察時應注意
5. 每次試劑用完后，請迅速蓋好，以免揮發，儲存時應避免高、低溫及陽光照射
6. 在涂抹痰標本時，嚴禁對玻片加熱
7. 染色時勿使玻片上的染液干燥
