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發布日期:2024/5/27 9:38:00

1. 感染預實驗

以 24 孔培養板為例,同時進行目的細胞和工具細胞的感染預實驗。工具細胞可選擇 293T(人胚腎上皮細胞)、H1299(人肺癌細胞)或其它細胞。實驗材料:培養基、24 孔培養板,移液槍,槍頭, EP 管,細胞計數板、冰盒、廢液缸等。(根據目的細胞情況,可酌情使用 Polybrene)

 

 



Day1:

準備細胞:培養細胞至對數生長期,細胞以胰酶消化計數后,用細胞計數測出細胞密度,每孔接種 5×104 個細胞,添加細胞培養液至 500μL。通常情況下,該接種量的 H1299 或 293T 細胞在感染后第 3 天可生長至 80%-90% 融合度。(接種目的細胞時,請根據細胞的實際生長速度調整接種量,使目的細胞感染后第 3 天生長至 80%-90% 融合度)

Day2:

(1)準備慢病毒顆粒:計算所需慢病毒顆粒的量,將凍存在 -80℃ 的慢病毒顆粒取出,冰浴融化;

(2)感染目的細胞:從培養箱中拿出細胞,置于顯微鏡下觀察細胞生長狀態及細胞融合度;如細胞狀態較好,則開始實驗:

A. 用移液槍小心吸去 24 孔板中的舊培養液,加入新的完全培養液;

B. 在細胞中分別加入計算好的慢病毒顆粒液,將培養板平置于工作臺上,以劃 8 字的方式輕柔混勻;

C. 混勻后,細胞培養板置于 37℃、5% CO2 培養箱,過夜培養。

Day3:

更換培養液:感染 12-16 小時后,吸出含慢病毒顆粒的培養液,重新向培養板添加含 5% 滅活 FBS(胎牛血清)的培養液,繼續培養。(目的細胞需要調整感染時長,部分細胞不可感染超過 12 小時。)

Day4:

繼續培養細胞,觀察細胞狀態是否有異常。

Day5:

觀察(評估)慢病毒顆粒感染效率:蓋緊 24 孔培養板,使用 70% 乙醇清理培養板外壁,在倒置熒光顯微鏡觀察熒光,拍照并估計慢病毒顆粒對細胞的感染效率。(如果慢病毒顆粒攜帶的基因表達所需的時間較長,熒光表達所需時間也較長,建議感染 72、96 小時后觀測熒光表達。)

根據熒光情況,可以初步從 MOI 梯度摸索實驗中,找出目的細胞的 MOI 值。
 

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