為了能夠長期的保存大腸桿菌菌種且不破壞其結構，通常將含有足量細菌的液體培養基離心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80℃凍存。之所以選擇甘油是因為甘油即使在超低溫凍結的情況下其體積也不會產生劇烈變化，不會導致由于其冰凍后體積的改變而壓迫菌種導致菌種結構的改變。等到需要的時候再將超低溫冷凍的菌體，融化并培養即可。由于此時僅僅需要將菌種培養至符合其種子液的數量要求而無需考慮培養產物以及繁殖速度等問題，所以一般采用最基礎的LB培養基即可。
LB培養基配方：胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4
液體培養基：
胰化蛋白胨 10.0g
酵母粉 5.0g
氯化鈉 10.0g
水 1000ml
pH 7.4
固體培養基：在液體培養基的基礎上再加入1.5％－2.0％的瓊脂
物料處理：
物料通常采用燒杯進行稱量主要是為了后續溶解方便并且不易外撒。
牛肉膏可采用小燒杯進行稱量，稱量后在進行溶解，避免與其他混合導致溶解困難。
蛋白胨由于其極易受潮故稱量時需快速。
以上稱量完成后，在上述燒杯中加入適量水進行加熱，并充分攪拌。待所配置藥品全部充分溶解的后，再加入適量水補足所需水分。
若需配置固體培養基則將稱好的瓊脂加入溶解液中并加熱溶解，帶加熱后再補足所需水分。
Ps：瓊脂溶解過程中注意不斷攪拌防止糊底或加熱過快導致溢出。
分裝滅菌：將上述步驟所得培養基按所需規格進行分裝并進行包裝，后放入高壓滅菌鍋進行滅菌即可。滅菌完成后需將其至于烘干機內烘干直至包裝的封口紙等干燥，即可進行后續的制版等操作。平板培養基制備完成后需倒置防止冷卻水滴入培養基內。
如有剩余培養基剩余可將其儲存于錐形瓶內進行保存，帶須使用時再進行微波爐加熱即可。
接種：
1.取制備大腸桿菌凍存液，管口用用酒精燈灼燒后方可打開。
2.接種方法一、用滅菌槍頭蘸取凍存液在平板邊緣上劃橫條，每三道為一組，旋轉平皿一圈，最后中間劃之字；接種方法二：用移液槍吸取溶液于平板上，用酒精燈滅菌厚的涂抹棒劃十字，涂布平板。通常采用的方法為方法一。
3.具體操作步驟：
一、將培養皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態，在火焰旁將培養皿稍微打開。在此同時，用環狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養皿內，在平板培養基的一邊，作第1次平行劃線 3～5條，轉動培養皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。
二、將菌液用移液槍在酒精燈旁接入錐形瓶內。此方法通常為確定菌種型號以及特性的情況下用于菌種繁殖。
Ps：平板劃線時需注意將保持接種針與板面之間的角度為30°，且出第一次劃線外其余均需將接種針與酒精燈上灼燒，消滅接種針上的殘余菌種。
大腸桿菌培養：將接種完成的培養基放入恒溫培養箱或恒溫振蕩培養箱內進行培養，即可得到所需的大腸桿菌菌落或種子液。
