菌種在分離、保藏和生產過程中，極易遭致雜菌污染，因此必須對染有雜菌的菌種進行提純，方能用于生產。根據污染的類型和程度，需采用不同的純化措施。
（1）排除細菌或酵母菌污染
在菌種培養中，用肉眼仔細觀察培養基表面，不難發現被細菌或酵母菌污染的分離物常出現黏稠狀的菌落。取被純化物接種在無冷凝水、硬度較高（瓊脂用量2.3%～2.5%）的斜面上，再降低培養溫度至15～20℃，利用某些大型真菌在較低的溫度下，菌絲生長速度比細菌蔓延速度快的特點，用尖細的接種針切割菌絲的前端，轉接到新的試管斜面培養基中培養，連續2～3次就能獲得所要的純菌絲。也可打破試管，挑取內部長有基內菌絲的瓊脂塊，移入無冷凝水的培養基上，該法適于被好氣性細菌污染的母種。
（2）排除霉菌污染
霉菌和細菌不同，它和食用菌菌絲很相似，也有氣生菌絲和基內菌絲。分離的方法主要是抑制雜菌生長，拉大食用菌菌絲生長和雜菌菌絲生長的范圍差，從食用菌菌落前端切割，移植入新培養基。雜菌發現越早，分離的成功率越大。嚴格地說，在斜面培養基上的非接種部位發現的白色菌絲，應認為是雜菌菌落，應馬上提純。若有色孢子已出現，一方面易使分生孢子飄散，另一方面其基內菌絲早已蔓延，可能和食用菌菌絲混生一起。如霉菌剛出現孢子且尚未成熟、變色，則可采用前端菌絲切割法提純。轉管時先將菌絲接種在斜面尖端，當長滿斜面后，及時將原接種點連同培養基一起挖掉；如霉菌菌落顏色已深，說明孢子已成熟，稍一振動孢子就會飄滿培養基，若再行上法意義不大。如菌絲蔓延范圍較大，可將0.2%升汞溶液或1%多菌靈處理過的濕濾紙塊覆蓋在霉菌的菌落上，可抑制霉菌生長，防止孢子擴散，后用滅菌接種鏟將表層鏟掉，隨之用接種針鉤取基內菌絲移入新的培養基，如此2～3次。
（3）限制培養
取直徑7～10毫米、高4～6毫米的玻璃環或不銹鋼環，經酒精燈火焰灼燒后趁熱放到斜面培養基中央，將環的一半嵌入培養基內，然后將染有細菌的接種塊放入環內進行培養。細菌生長會被限制在環內，而食用菌菌絲則可越過環而長到環外的培養基上，轉管后即可得到純化。
（4）覆蓋培養
在污染了細菌的食用菌菌絲斜面上傾注一層厚約2毫米的培養基，培養一段時間，當食用菌菌絲透過培養基形成新的菌落時，即可切割轉管。最好進行二次覆蓋。
（5）基質菌絲純化培養
對棉塞長有霉菌的試管斜面，可將試管打碎，取出培養基，用0.1%升汞浸泡2分鐘，用無菌水淋洗，再用無菌濾紙吸干。取一段2厘米的培養基從中部切開，在斷面上用無菌刀片切成米粒大小的塊，移入新的斜面上進行培養。
（6）藥物處理
菌種提純時，可向培養基中注入選擇性強的抗菌制劑，如加入 5～10毫克/升的多菌靈（MBC）、涕必靈（TBZ）或托布津等，可有效地防止菌霉混生；在每毫升培養基中加入30～40毫克鏈霉素、20～30毫克四環素、金霉素，或50毫克高錳酸鉀，可以有效地防止細菌混生；加入灰黃霉素（20單位/毫升），可抑制真菌生長。
（7）破碎菌絲
從試管中取出已污染的培養基，放在0.1%升汞水中處理2分鐘，用無菌水沖洗，無菌紙吸干，再放入有玻璃珠的無菌水內，經組織破碎，稀釋后注入平板培養，取其單個菌落純化培養。
