熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室中出鏡率非常高的一種技術(shù)手段。它通過在PCR體系中添加熒光基團(tuán)來顯示DNA產(chǎn)物的累積情況，從而達(dá)到對(duì)PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的目的。并且可以通過數(shù)據(jù)分析計(jì)算出起始模板量，這就是“熒光定量”中“定量”一詞的來源。
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)因?yàn)殪`敏度高所以經(jīng)常是差之毫厘謬以千里，所以在實(shí)驗(yàn)過程中，我們需要注意諸多細(xì)節(jié)，謹(jǐn)慎操作。小伙伴們看到這里就要著急了，我怎樣才能做好qPCR實(shí)驗(yàn)，拿到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)表高分文章，走上人生巔峰呢？
引物設(shè)計(jì)的好壞，關(guān)乎著擴(kuò)增效率的高低、產(chǎn)物特異性的與否。所以正確設(shè)計(jì)出引物是qPCR成功的第一步。
首先，我們知道qPCR是特殊的PCR，所以，qPCR的引物設(shè)計(jì)要滿足一般PCR引物設(shè)計(jì)的原則，見下表。
除此之外，qPCR引物設(shè)計(jì)需要額外注意幾點(diǎn)。
1. 擴(kuò)增片段長度：
擴(kuò)增效率隨著擴(kuò)增子長度減小而增大，建議擴(kuò)增產(chǎn)物最好在80-200bp的范圍，若產(chǎn)物小于75bp，擴(kuò)增子很難與引物二聚體區(qū)分開，若產(chǎn)物大于300bp，則會(huì)因?yàn)槊富罱档蛯?dǎo)致擴(kuò)增效率降低。如果你的擴(kuò)增產(chǎn)物因?yàn)閷?shí)驗(yàn)需求一定要在500-600bp的話，做qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)要選用三步法擴(kuò)增，不要用快速兩步法擴(kuò)增。
2. 區(qū)分isoform：
對(duì)于同一個(gè)基因名來說，可能會(huì)有不同的isoform。isoform指的是，對(duì)于同一個(gè)基因，它的mRNA有多種不同剪接方式，這個(gè)時(shí)候表達(dá)出來的的蛋白可能會(huì)有不同，所以小伙伴們?cè)谠O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，一定要想清楚自己要做的是哪一個(gè)isoform。
舉個(gè)“栗子”：比如說一個(gè)基因有四種不同的isoform，如果大家想要檢測的是四種不同剪接方式轉(zhuǎn)錄本之和，那么設(shè)計(jì)引物時(shí)就要針對(duì)這四個(gè)isoform的共有序列設(shè)計(jì)。如果只想檢測其中一種isoform，那就要在這個(gè)isoform與其他三個(gè)isoform的不同序列位置設(shè)計(jì)引物。
3. 跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物：
跨越內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物可以區(qū)分并且規(guī)避基因組DNA污染。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要讓一端或兩端引物跨越內(nèi)含子，以人基因組來說，平均每個(gè)基因有8.8個(gè)外顯子和7.8個(gè)內(nèi)含子，80%的外顯子長度小于200bp，少于10%的內(nèi)含子長度在1100bp以上，不到0.01%的內(nèi)含子長度小于20bp。（Sakharkar MK et al. Distributions of exons and introns in the human genome[J].In Silico Biol. 2004;4(4):387-93.）例如外顯子長度200bp，為了兼顧擴(kuò)增子長度，我們可以把上游引物設(shè)置在外顯子1和外顯子2的中間，下游引物設(shè)置在外顯子2的位置。
