1 、操作因素
1.1 涂片太厚 在涂片時細菌挑的太多，沒法分開，在脫色時就不能將第一步染上的結晶紫的顏色脫去，可能會使革蘭陰性菌也出現紫色，誤認為革蘭陽性菌。
1.2 脫色時間
陽性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時間條件下的結果，如果延長脫色時間，也會使脫色劑滲透進陽性菌的細胞壁中，使染上的結晶紫脫去顏色，最后染上復紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時間太短的話又會使陰性菌染上的結晶紫不能完全脫色，出現紫色，誤認為革蘭陽性菌。
1.3 固定方法
固定不僅能殺死細菌，改變細菌對染料的通透性，還能使細菌吸附在玻片上，保持原有的形態結構。固定方法是將干燥后的細菌涂片以中等速度通過火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實際操作中有的同學將玻片在火焰上烤的太久，改變了細菌原有的通透性，會使細菌的染色性發生變化。影響了染色的結果。
2 、細菌因素
2.1 細菌培養時間
細菌的典型形態、染色性是在對數生長期，取這時的細菌做革蘭染色可以反應細菌的真實的染色性。如果細菌培養時間太長，變成了老齡菌，染色性就會發生變化，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
2.2 培養基的成分
一般認為革蘭陽性菌體內含有特殊的核蛋白質鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結晶紫的復合物結合很牢，不易脫色。但是如果培養基中缺乏核蛋白質鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質鎂鹽，細菌與碘和結晶紫的復合物結合就不牢固，容易脫色，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
3 、染液因素
3.1 碘液
碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時間太長，或經日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結晶紫與細菌結合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
3.2 結晶紫 結晶紫的濃度太高，就會使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌。
3.3 酒精 酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95% ，在此濃度下革蘭陽性菌染上的結晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結晶紫容易被脫去，最后呈紅色。但當酒精的濃度為70% 時，它的脫色能力最強，可能使革蘭陽性菌染上的結晶紫也被脫去，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
綜上所述，影響染色的其他因素，還有菌體細胞的構造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結構完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養基的組成、菌齡、染色液中的電介質含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細菌的染色，所以我們在染色時要注意當染色結果與預想的結果出現不一致時，要考慮到這些因素的影響。對同學來講重點強調操作因素的影響，使他們在一開始學習革蘭染色，就認真對待，養成良好的學習態度，嚴格按照操作規程來做，提高實驗結果的準確性。
